如上期博客中提到，早期玻璃化冷凍實驗是在傳統(tǒng)低溫貯存容器中進行的，如0.25ml塑料精液麥管或凍存管。這些工具并非為這個目的而設(shè)計，它們的管壁較厚，所需液量較大（麥管需5-7μl；凍存管需10μl以上）。因此，理論上可實現(xiàn)的降溫和復(fù)溫速率非常有限（麥管大約在2000℃/min；凍存管的速率更低，所幸很快就被淘汰）。為了避免麥管的崩裂或爆炸，我們在降溫和復(fù)溫時采用兩步法，然而這些操作勢必會增加操作的不一致性。此外，這些大體積液體在極端壓力變化下的不均勻凝固導(dǎo)致了玻璃化的冷凍液開裂和內(nèi)部細胞的破裂。所以，傳統(tǒng)冷凍的低效性并沒有被消除，反而是大部分的問題沒解決的情況下又增加了更多的障礙。毫無疑問，我們需要新的載體。

多虧哺乳動物胚胎學(xué)家驚人的“創(chuàng)造力”，十多年來沒有發(fā)生任何進展，幾乎所有的“專家”都接受了這些限制和缺陷。好吧，我不得不承認——在這漫長的七年里，我在這種無能為力中也扮演了重要的角色。

當然在這期間也有過一些初步的嘗試，例如在無任何載體的情況下直接將胚胎滴入液氮中（Lauda and Tepla, 1990）。很棒的主意，可惜它不起作用，第一次的嘗試就可以證明這一點。為了形成液滴，最少需要5μl高濃度的冷凍液，這與取得適當?shù)慕禍厮俾蔬€差很遠。另外，一旦液滴到達液氮表面時會開始漂浮并且會在水面上維持長達數(shù)秒的無規(guī)則的游動。原因很簡單：液氮在零下196℃達到沸點。任何溫度較高的東西，如我們的液滴和樣品都會引起液氮的大量蒸發(fā)，產(chǎn)生的蒸汽層就像一個很好的隔熱層，能夠阻止液滴下沉，這樣的操作的結(jié)果甚至于測量不到的冷卻速率，可以說是慘不忍睹的。基于這個三重缺陷的方法的論文被重復(fù)發(fā)表了10年之久。

另一種途徑是液滴最小化法（Arav, 1992），這是一種明顯改進并值得注意的方法。但是這個方法需要昂貴的低溫顯微鏡，無法用于日常實踐。

最終電鏡銅網(wǎng)作為載體開始被應(yīng)用，這是一個有著巨大潛力的方法，是第一個充分利用小液體量并使用了直接接觸的方式（Martino et al, 1996）；事實上這也是迄今為止最好的解決方案之一。盡管對液體體積的標準化和一致性依然是個問題，但少量的液體。導(dǎo)熱金屬增加了冷卻和復(fù)溫速率，快速固化的液膜使樣品安全地放在表面上，加熱后取出也很容易和安全。這種小金屬網(wǎng)改變了游戲規(guī)則，為降低低溫保護劑濃度和開發(fā)小體積直接接觸方法的實用價值開辟了道路。

然而，由于載體微小，缺乏正確識別和實際存儲的解決方案，限制了其在實驗實驗室的應(yīng)用。

我們必須明白：胚胎學(xué)家更喜歡使用麥管工作。胚胎實驗室里的所有東西，或者幾乎任何樣本如：早期胚胎、囊胚、精子、卵母細胞（其中只有一小部分在以往的存貯方法中存活）都是低溫存貯在麥管里的。所有的杜瓦罐和其它液氮容器也都是為麥管存貯而設(shè)計的。他們不想為了進入一個新領(lǐng)域的挑戰(zhàn)而放棄整個基礎(chǔ)設(shè)施。

因此，如果他們想要麥管，我們就提供經(jīng)適當?shù)母倪M后的麥管給他們。這就是第一個專門為達到少液體量和高降溫/復(fù)溫速率目的而設(shè)計的玻璃化載體——敞開式拉管OPS（ Vajta et al., 1998）。

好處是顯而易見的。易于操作，它就像是一支筆。通過液滴和毛細作用，使用極少量的液體輕松加載。由于樣品一直懸浮在液柱中，因此不會附著在表面上，也不會變形。液柱和管狀結(jié)構(gòu)也防止了加載后滲透壓變化帶的風險。在有著相對堅固和安全的構(gòu)造的前提下，OPS的降溫和升溫的速度還是達到了要求。在降低了保護劑的濃度的同時取得了包括人類在內(nèi)的許多哺乳動物的胚胎和卵母細胞的高存活率，容易存儲在液氮罐中，利用管內(nèi)受熱膨脹的空氣自動排出樣本，在解凍皿中輕松地復(fù)蘇樣本。

根據(jù)我個人的看法，對一個初學(xué)的胚胎學(xué)家而言，學(xué)習(xí)和持續(xù)使用OPS在學(xué)習(xí)和使用在比過去22年中其它任何設(shè)計或商業(yè)化的高速率玻璃化冷凍載體都要簡單。更重要的是，在OPS之后引入的方法都不能提供更好的存活率、更一致的結(jié)果或更廣泛的適用性。The original is the best.

這或許只是純粹的運氣，但事實的確如此。

當然還有其它選擇，比想象的還要多。據(jù)估計，目前至少有100種高速率玻璃化方法。有好幾年，幾乎所有與玻璃化冷凍打交道的人都通過細微的改變建立自己的玻璃化裝置和方法，更不用說個人因素。創(chuàng)造只是問題的一部分，第二項任務(wù)也許更具挑戰(zhàn)性，就是命名?！癈ryo”和“Vitri”絕對是用得最多的，后面接上不同的后綴，如“l(fā)eaf、top、lock、tip、safe、inga”等，其中也包括用玻璃微管（請注意有些國家使用玻璃進行低溫存貯是不合法的）改造的OPS、膠質(zhì)上樣吸頭、密封式拉抻麥管（CPS）、無菌剝卵管、移液吸頭；這僅僅是一小部分例子。

哪一個是贏家？

如果我們從數(shù)量上看，贏家是那些有強大商業(yè)背景支持的。如果我們從科學(xué)認知角度上看，情況就不一樣了。關(guān)于OPS的原始描述的文獻（Vajta et al., 1998）仍然是玻璃化領(lǐng)域中被引用得最多的。這個方法廣泛應(yīng)用于和玻璃化相關(guān)實驗和家畜胚胎學(xué)中, 世界上幾乎所有的冷凍保存后胚胎誕生的克隆動物都是使用OPS方法。如之前所述，一種后來改變了整個人類輔助生殖嘗試：首例通過玻璃化存貯的人類卵母細胞誕生的嬰兒是通過使用了OPS方法，OPS仍然是人類胚胎干細胞玻璃化最有效的方法。

    雖然 OPS的商業(yè)化被推遲了，但如今韋拓生物生產(chǎn)的敞開式?；瘍龃婀埽∣PS）相繼獲得美國FDA認證和中國醫(yī)療器械注冊證并陸續(xù)開展全球銷售。我完全相信，在未來幾年內(nèi)，OPS將成為中國乃至世界范圍內(nèi)最受歡迎的人類胚胎和卵母細胞冷凍保存技術(shù)之一。

當然，這只是開始。

參考閱讀：

1. Vajta G. Vitrification in ART: past, present, and future. Theriogenology 2020 (in press).

2. Vajta G. Vitrification in human and domestic animal embryology: work in progress. Reproduction, Fertility and Development 2013; 25:719-727.