3. 大分子物質(zhì)在低溫保存時(shí)并不是必需的，但添加這些物質(zhì)是非常可取的。它們的作用很難具體說明，一般來說，它們可以保護(hù)樣本并提高存活率和隨后的發(fā)育率。產(chǎn)生這種效果的一方面原因可能是滲透壓的貢獻(xiàn)，因?yàn)榭梢允褂酶蜐舛鹊姆菨B透和滲透冷凍保護(hù)劑（見下文）；另外一方面的原因可能是溶液黏度的增加會(huì)減少操作過程中的機(jī)械損傷。大分子物質(zhì)可阻止卵母細(xì)胞和胚胎附著在塑料和玻璃皿表面，也可以通過簡(jiǎn)單的覆蓋或特定的結(jié)合來保護(hù)細(xì)胞膜。
在胚胎學(xué)領(lǐng)域，有一項(xiàng)持續(xù)了50年的嘗試，即在所有過程中使用有著明確定義化學(xué)成分的的培養(yǎng)液，以增加一致性和減少污染的危險(xiǎn)。盡管人們進(jìn)行了多次嘗試， 可直到今天，這些努力大部分都還是失敗了。 其中被認(rèn)為最有前景的是聚乙二醇（PEG），聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚蔗糖。然而，獨(dú)立的比較研究發(fā)現(xiàn)這些成分的效率都低于蛋白質(zhì)。
近年來，羥丙基甲基纖維素（HPMC）被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。種材料是由纖維素經(jīng)過相當(dāng)劇烈的化學(xué)改性而制成的，它既可用于醫(yī)療目的（包括局部眼部治療和藥物表面涂層），也可作為無麩質(zhì)面包的谷蛋白替代品。它不會(huì)被消化道吸收，因此被認(rèn)為是無毒的。
然而，它可能在眼部治療時(shí)會(huì)引起過敏反應(yīng)，也可能會(huì)引起腸胃不適，但這正是谷蛋白敏感的人希望消除的。盡管有一些支持性的論文，但是根據(jù)以下的原因，我們?cè)贖PMC的使用上仍需要一定的謹(jǐn)慎。
a: 玻璃化溶液的濃度相對(duì)較高；
b: 對(duì)玻璃化的樣本，尤其是復(fù)蘇后的樣本缺少保護(hù)機(jī)制；
c: 在體外沒有任何屏障（如腸壁）來保護(hù)卵母細(xì)胞和胚胎。
在體外受精培養(yǎng)基中最常見的大分子是從人血清或血漿中提取的蛋白質(zhì)。這一類的產(chǎn)品種類繁多，包括最常見的人血清白蛋白（HSA）、含球蛋白和脂蛋白的血清代物（SSS），以及來自世界各地不同生產(chǎn)商的類似添加劑。早些時(shí)候，人血清也在這個(gè)清單上，但因?yàn)槎拘院蜐撛诘奈廴締栴}，它就不再被使用了。在世界上許多國(guó)家，政府會(huì)通過法規(guī)來限制在生殖過程中使用這些添加劑。幸運(yùn)的是，在人類細(xì)胞的玻璃化中，HSA的使用不受限制并且它是完全適合于玻璃化。
4. 抗凍蛋白很難分類。根據(jù)定義，它們既是大分子物質(zhì)又是冷凍保護(hù)劑。它們是生活在惡劣環(huán)境中的生物體的產(chǎn)物，因?yàn)檫@些生物體需要在零度以下的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間生存。這些蛋白在一定程度上可以阻止冰晶的形成。在幸運(yùn)的情況下，與冰點(diǎn)有幾度溫差也足以保證生存。
為了把我們從分類的任務(wù)中解放出來，我不得不告訴你，分類沒什么必要，因?yàn)檫@些蛋白可能也是不需要的。在過去的30年里，這些抗凍蛋白的應(yīng)用在發(fā)表了幾篇論文后反復(fù)出現(xiàn)和消失。也許它們?cè)谀承┘棺祫?dòng)物的未來超低溫保存中會(huì)有一些有限的作用，但在我們（對(duì)不起，是你）的生命和我們?nèi)祟愔惺遣惶赡艿摹?/p>
5. 冷凍保護(hù)劑是玻璃化溶液中最重要且?guī)缀醪豢苫蛉钡某煞帧?duì)于雄性配子來說，這種 “幾乎” 是必需的，其結(jié)構(gòu)極為緊湊、含水量低，為無冷凍保護(hù)劑的玻璃化提供了一定的機(jī)會(huì)。
然而，對(duì)于大而致密化的卵母細(xì)胞，以及從受精卵到孵化囊胚的所有階段的胚胎來說，冷凍保護(hù)劑是絕對(duì)需要的。
這些化學(xué)物質(zhì)可以是滲透性的，也可以是非滲透性的。
這不僅僅是一個(gè)（愚蠢的）“學(xué)術(shù)”詭辯，它還意味著一項(xiàng)不同的任務(wù)，盡管這項(xiàng)任務(wù)略有重疊。
非滲透性冷凍保護(hù)劑的作用是在降溫前通過逐步增加緩慢的壓榨作用，將水從胞質(zhì)中擠出，并使細(xì)胞在復(fù)蘇時(shí)不因滲透休克而漲破。他們實(shí)際上沒有更多的功能，只是壓縮和保持壓縮，唯一的額外要求是無毒。從這個(gè)角度來看，蔗糖和我們?nèi)粘Ｉ钪酗嬘玫目Х?、茶和含糖可樂中最?jiǎn)單的糖沒有差別。所以，僅僅是普通的蔗糖，沒有別的了。
比較勢(shì)利的版本是海藻糖，然而它也只是另一種糖而已，沒有任何額外的好處，只是價(jià)格高得多。不管怎樣，有些人更喜歡阿斯頓·馬丁，而我開著一輛有20年歷史的豐田巡洋艦。
讓我們繼續(xù)冷凍保護(hù)劑這個(gè)話題，另一組冷凍保護(hù)劑也與汽車相關(guān)。
有機(jī)溶劑是極好的冷凍保護(hù)劑，包括傳奇的甘油。但是其他的，包括傳統(tǒng)的乙醇，也被成功地用于這一目的。（一些實(shí)驗(yàn)室——包括世界著名的實(shí)驗(yàn)室，對(duì)使用乙醇噴霧凈化表面非常偏執(zhí)。他們可能不知道胚胎可以忍受濃度高達(dá)10%的酒精長(zhǎng)達(dá)幾分鐘，這種環(huán)境甚至可以刺激它們的發(fā)展。沒有人能在血液中酒精濃度達(dá)到這種濃度十分之一時(shí)存活）
但說到汽車，乙二醇（EG）是一種毒性較低、最有效、最可靠的玻璃化冷凍保護(hù)劑，也是汽車?yán)鋮s液最重要的組成部分。原理是一樣的，防止結(jié)冰。我們只是運(yùn)氣好，解決辦法就在我們的車庫(kù)里。
可惜單獨(dú)使用乙二醇（EG）并不是最好的策略。所有可滲透的冷凍保護(hù)劑都有一定的毒性作用，但這種作用在不同的低溫保護(hù)劑之間是不同的。如果我們使用兩種冷凍保護(hù)劑，每一種的毒性均減半，冷凍保護(hù)效果保持不變甚至?xí)岣摺?/p>
無論如何，仍然有許多團(tuán)體和生產(chǎn)商信任二甲基亞砜，并抵制一些生產(chǎn)商的廣告宣傳替代品（丙二醇）是“無毒的”——事實(shí)上，其毒性比二甲基亞砜高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，更重要的是——效率更低。
是的，但是第二種可滲透的冷凍保護(hù)劑應(yīng)該是什么呢？在這里，實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)商之間的爭(zhēng)論是激烈的，戰(zhàn)斗到第一滴血，甚至更進(jìn)一步。其中有幾個(gè)候選，但兩個(gè)最具競(jìng)爭(zhēng)力的是丙二醇和二甲基亞砜（DMSO）。
事實(shí)上，DMSO只是運(yùn)氣不好。它是一種優(yōu)秀的冷凍保護(hù)劑，也是一種優(yōu)秀的溶劑，毒性比其它競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手都小。作為一種良好的溶劑，它被用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中溶解可疑的致癌物質(zhì)。它的效果很好，但是由于效果太好了以至于降低了被測(cè)試的溶解物質(zhì)的致癌作用。所以他們停止使用它。
現(xiàn)在許多科學(xué)家只聽到了部分故事，并將DMSO與致癌聯(lián)系起來。這聽起來很像那個(gè)“卷入搶劫案”的人。是的，他參與了，他被搶劫了……
無論如何，仍然有許多團(tuán)隊(duì)和生產(chǎn)商相信DMSO， 并抵制一些生產(chǎn)商把丙二醇作為“無毒”的廣告。事實(shí)上，丙二醇的毒性比DMSO大一個(gè)數(shù)量級(jí)，更重要的是，它的效率更低。
當(dāng)我在丹麥做牛胚胎學(xué)家的時(shí)候，我有幸研究了成千上萬的卵母細(xì)胞和胚胎。我利用這個(gè)機(jī)會(huì)測(cè)試了這些冷凍保護(hù)劑的許多可能的組合。最后發(fā)現(xiàn)了EG和DMSO在稀釋的和濃縮的溶液中的最佳比例。
所以，我們有了這樣的組合:
HEPES緩沖的TCM
人血清白蛋白
蔗糖
二甲基亞砜
乙二醇
當(dāng)然，還有OPS敞開式玻化凍存管
拓展閱讀：
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