? ? ? ?在玻璃化冷凍后，解凍操作方法建議在1M蔗糖中解凍，在0.5 M蔗糖中稀釋，并在基礎(chǔ)液中進(jìn)行5 + 5分鐘的洗滌/再水合，有的方法建議在最后兩種無糖基礎(chǔ)液中只需要5 + 1分鐘的再水合時間。我個人認(rèn)為第一種方法更可靠，下面請允許我分享下自己的理解和一些實踐經(jīng)驗。
? ? ? ?二甲基亞砜（DMSO）和乙二醇（EG）是胚胎學(xué)中使用的毒性最小的滲透性冷凍保護(hù)劑。不過，它們也不是完全無害的。胞質(zhì)內(nèi)冷凍保護(hù)劑的濃度盡管遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于最初的玻璃化冷凍方法，但是所需的濃度依然很高，而且與普遍的看法即濃度不高于傳統(tǒng)的慢速冷凍法相反。解凍后，存在于細(xì)胞質(zhì)中（或囊胚的囊胚腔中）的高濃度冷凍保護(hù)劑需要足夠時間脫離，而大多是被動的。
? ? ? ?同時，卵母細(xì)胞和胚胎的代謝狀態(tài)嚴(yán)重受損，修復(fù)也需要時間。不是幾分鐘，很可能是幾個小時。如果在此期間胞質(zhì)中存在DMSO和EG，修復(fù)就會延遲，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，或影響后續(xù)的發(fā)育。
? ? ? ?在做牛胚胎研究中，我發(fā)現(xiàn)牛胚胎克隆和激活后，需要徹底的洗滌。比如，牛的重構(gòu)胚經(jīng)DMAP激活后，在操作液中清洗3次，5分鐘后再進(jìn)行體外培養(yǎng)。這一步驟通常發(fā)生在深夜，一天的辛苦工作之后，胚胎學(xué)家想回家睡覺。因此，對于一些胚胎來說，最后5分鐘的清洗時間有時會縮短甚至省略。幸運的是，我們培養(yǎng)的胚胎要么是單獨培養(yǎng)，要么是少量共培養(yǎng)，第一批和最后一批之間的差異是相當(dāng)令人震驚的。幾次失敗后，我們不得不意識到——無論是否累了、餓了、困了，我們必須進(jìn)行徹底清洗，否則，一整天的工作就白費了。
? ? ? ?如果這種情況發(fā)生在DMAP激活液上，或許也有理由相信有可能發(fā)生在DMSO和EG上。我開始關(guān)注玻璃化冷凍復(fù)蘇后的情況，發(fā)現(xiàn)了一些意想不到的問題。
? ? ? ?研究顯示，徹底清洗是十分必要的。缺乏這一點可能不會立即導(dǎo)致戲劇性的改變，但結(jié)果的一致性將會降低。如果省略最后5分鐘，玻璃化后的胚胎會更敏感。如果用微滴單獨培養(yǎng)；或大液滴共培養(yǎng)，胚胎彼此接近，生存就會受到損害。此外，不同發(fā)育階段之間存在的敏感性差異也可能產(chǎn)生影響。卵母細(xì)胞表面再水合對卵母細(xì)胞的傷害可能比晚期胚胎更大。盡管如此，囊胚和擴張囊胚也可能因不精細(xì)的操作而受影響。
? ? ? ?有些觀點可能認(rèn)為胚胎直接移植，即胚胎在解凍后幾分鐘，用蔗糖溶液將胚胎直接移植到子宮（指的是牛的胚胎移植）。這是一個完全不同的問題，在那種情況下，我們是幸運的。與培養(yǎng)皿不同的是，子宮提供了一個良好的環(huán)境，可以安全有效地補充水分，并適當(dāng)?shù)馗鼡Q溶液。同時，這個過程似乎是一致的和緩慢的——不用著急，無需秒表，沒有流程。對于人類，對于病人，對于手術(shù)室，這種精確的時間安排是非常困難和危險的。
? ? ? ?在實驗室里，有成百上千的（保守估計的）因素可能導(dǎo)致不一致的結(jié)果。我們必須盡力降低風(fēng)險。為了培養(yǎng)這些胚胎，需要許多人（準(zhǔn)父母和他們的家人、醫(yī)生、胚胎學(xué)家、護(hù)士、行政人員等）的共同努力。為了消除哪怕是極小會失敗的可能性，我們這4分鐘的等待可能都是值得的。結(jié)果可能不會有驚人的不同，但從長期來看，可能會在一致性方面有一些改善。